DNK.profiliranje

Vruća tema – DNK profiliranje pasa – ko, šta, kako, zašto?

Napisala: Mateja Janeš, mag.ing.agr.

Autorica članka završila je Animalne znanosti kao preddiplomski i Genetiku i oplemenjivanje životinja na Agronomskom fakultetu sveučilišta u Zagrebu, gde je upisala doktorske studije s područja populacijske genetike pasa pod mentorstvom prof.dr.sc. Vlatke Čubrić Ćurik, dok laboratorijski deo molekularne genetike trenutno dovršava na Odjeljku za Zootehniku Biotehnićkog Fakulteta u Ljubljani pod vođstvom prof.dr.sc. Petera Dovča. (op.ur.)

1. Šta je DNA profil?

DNA profil (još zvan i DNA otisak, DNA testiranje ili DNA tipizacija) je forenzička tehnika koja se koristi za identifikaciju pojedinaca po karakteristikama njihove DNA.
DNA profil je mali skup varijacija DNA koje su vrlo verojatno različite za sve nesrodne jedinke tj. one koje nisu potomci istih predaka – rođaci, braća, sestre, bratići, nećaci…
To čini DNA profile jedinstvenima za svakog psa baš kao što je kod ljudi jedinstven otisak prsta.
Modernu tehniku DNA profiliranja je 1984. razvio Sir Alec Jeffreys dok je radio na Odelu za genetiku na Sveučilištu u Leicesteru i otad se koristi u kriminalističkim istragama, kao dokazivanje očinstva kod ljudi, ali i u životinjskim i biljnim populacijama za populacijske studije.

2. Šta se DNA profiliranjem želi postići?

DNA profiliranjem pasa planira se smanjiti falsifikovanje podataka izdanih u pedigreu, odnosno rodovniku.
Rodovnik psa je ukratko – popis svih predaka psa do tri, a u nekim zemljama i više generacija unazad, koji je službeno priznat od kinološkog saveza te zemlje.
Lično smatram da bi rodovnik trebao biti tačan, ali ima puno slučajeva falsifikovanja, a nekada čak i pogrešaka.
Šta u tom slučaju?

U doglednoj budućnosti DNA profiliranje če se raditi za parnjake, tj. roditelje štenaca – a pri pregledu legla, odradit će se i za celo leglo.
Može li se i to falsifikovati? Puno teže, iako se sve može.

Ali čak i tada, kada kupite profiliranog psa ukoliko iz nekog razloga posumnjate, moći ćete u bilo kojem trenu i u bilo kojoj laboratoriji na svetu koji radi DNA profiliranje, napraviti profil i proveriti tačnost onog koji ste dobili ranije i u koji ste posumnjali.

Isto tako, možete uzeti i uzorke roditelja i proveriti jesu li to stvarno roditelji vašeg psa, pošto DNA profil nije nešto što se menja. On ostaje isti kroz celi život pa makar ga vi ponovili 500 puta.

Zabluda o DNA profilu

Javljaju se neke dezinformacije vezane za DNA profiliranje. DNA profili jesu genetski markeri, međutim oni nam ne daju kompletne genetske informacije o nekom psu. Oni NISU testovi za proveru genetskih predispozicija za neke bolesti.
Oni se koriste za identifikaciju pojedinog psa i proveru očinstva/majčinstva.
Ili recimo, ako na kuju u fazi teranja naskoči više mužjaka, kuja može ostati gravidna samo s jednim ili može imati štence od više parnjaka.
Kako to proveriti?
Pa evo opet načina da se to utvrdi. Uporedite DNA profile kuje i svih parnjaka sa profilima štenaca i voila!
Isto možete učiniti i ako kuja ostane gravidna, a niste videli ko ju je naskočio, ali sumnjate na određenog mužjaka.

Dakle, da ponovimo, DNA profilima mogu se proveriti:

a) Jedinstveni genetski potpis – identifikacija jedinke
b) Genetski odnosi među pojedincima
c) Proveriti realni, stvarni inbreeding
d) Proveriti genetska distanca (veličina genetskog bazena, različitost gena u populaciji)

Za one koji žele znati više

1. Šta je DNA profil?

Kod svake vrste životinja, za sve jedinke te populacije – 99,9% sekvenci je identično. No, ovih 0,1% razlike je sasvim dovoljno da bi na genetskom nivou mogli razlikovati jednu jedinku od druge.
Dobro, osim ako se ne radi o jednojajčanim blizancima koji su genetički potpuno isti, jer su se razvili od iste jajne stanice te istog spermija i ustvari su jedini prirodni klonovi.
Tu je vrlo dobro napomenuti da svi štenci u istom leglu nisu jednojajčani blizanci, ali poneki mogu biti.
To je genetički potvrđeno tek 2016. godine. Pre se mislilo i da svako štene nosi tačno 50% gena od majke i 50% od oca i da su svi štenci u leglu genetski isti.
Međutim, danas se pouzdano zna da su štenci u leglu međusobno genetski više ili manje različiti i da je samo zbir svih gena svih štenaca iz jednog legla otprilike polovina od majke polovina od oca.

2. Šta su DNA profili i kako se analiziraju?

DNA profil koristi ponavljajuće sekvence koje se jako razlikuju od jedinke do jedinke, zovu se VNTR – tandemska ponavljanja varijabilnog broja, STR – kratka tandemska ponavljanja, ili mikrosateliti i minisateliti.
To su doslovno tandemska ponavljanja odredenih motiva DNA (koji se sastoje sa od 2 do 7 parova baza) a koji se ponavljaju od 5 do 50 puta.
Na primer sekvenca TATATATATA je dinukleotidni mikrosatelit koji se ponovio 5 puta, a CTGCTGCTGCTGCTG je trinukleotidni mikrosatelit koji se takođe ponovio 5 puta (pri čemu su baze: A adenin, G gvanin, C citozin i T timin).

Mikrosateliti su vrlo slični kod bliskih srodnika, ali su vrlo različiti u celoj populaciji neke pasmine i verovatnost da su isti kod dve slučajno odabrane jedinke je izuzetno mala. Tako je i DNA štenaca unutar legla slična, ali ne i potpuno ista (ponovo, osim kod jednojajčanih blizanaca), no uvek je kombinacija majčine i očeve DNA.

Ova slika prikazuje mikrosatelite od oca, majke i njihovo dvoje dece. Mikrosateliti se uvek sastoje od dva alela odredenih dužina koje su ovde označene brojkama.
Psi mogu biti heterozigoti i imati jedan alel različit od drugoga, kao što na slici prikazuju otac majka i dete 2, ali i homozigoti što znači da imaju dva ista alela (alela iste dužine), na slici je to dete 1.
Aleli dece MORAJU BITI I UVEK JESU kombinacija očevih i majčinih alela.
Dete 1 je dobilo alel 2 (251.44) i od majke i od oca.
Dete 2 je dobilo alel 1 (249,66) od oca i alel 6 (258,65) od majke.

Pošto su mikrosateliti dosta komplikovani za shvatiti, pokušala sam gornju tablicu objasniti pomoću slike:

Dakle, s leve strane imamo zamišljenu porodicu Kavalir španijela kralja Charlesa. Prvi odozgo je otac, druga majka i zatim dvoje štenaca iz istog legla.
Višnja, kruška i jabuka prikazuju naše mikrosatelitne alele. Pošto se mikrosateliti uvek sastoje od dva alela, ovde je to prikazano kao da svaki pas ima po dve voćke. Otac ima alele višnju i krušku. Majka alele krušku i jabuku. Smeđe belo štene ima alele dve kruške, a trobojno štene ima alele višnju i jabuku.
Onaj koji ima dve različite voćke je heterozigot (mama, tata i trobojno štene), a onaj koji ima dve iste voćke
(smeđe belo štene) je homozigot.
Aleli štenaca MORAJU BITI I UVIJEK JESU kombinacija očevih i majčinih alela odnosno naša „voćna salata“.
Tako je naše smeđe belo štene nasledilo jednu krušku od oca i jednu krušku od majke, a trobojno višnju od mame i jabuku od oca.

Štene koje bi nasledilo dve jabuke moglo bi biti potomak samo majke, ali sigurno ne i ovog oca jer on nema alel jabuku.
A štene koje ima alele samo višnje moglo bi biti potomak ovog oca, ali sigurno ne i ove mame, jer ona nema alel višnju.
Takođe, psi koji nemaju alele ni višnje ni kruške ni jabuke, ali umesto toga imaju recimo alele bananu, lubenicu i grožde, uopšte ne mogu biti potomci ovih naših majke i oca. Možda čak nisu ni čistokrvni kavaliri.
Genetski rečeno, imaju različite alele za ove mikrosatelite od naših pasa.

3. Kakvi su to certifikati koji se spominju?

Za DNA profile koristi se Thermo Scientific Canine Genotypes Panel 1.1 i on obuhvata 19 takvih mikrosatelitnih lokusa koji se zovu redom: AHTk211, CXX279, REN169O18, INU055, REN54P11, INRA21, AHT137, REN169D01, AHTh260, AHT253, INU005, INU030, Amelogenin, FH2848, AHT121, FH2054, REN162C04, AHTh171 i REN247M23.
Ti su markeri uključeni u „glavni panel“ lokusa, a preporučeni su od Odbora Za Primenjenu Genetiku Za Kućne Ljubimce Međunarodnog Društva Za Genetiku Životinja čija je skraćenica ISAG.
ISAG sprovodi godišnje testove uporedbe laboratorija i tada šalju slepe probe uzoraka za mikrosatelitnu analizu, koje potom laboratorije širom sveta analiziraju i svoj konačan rezultat šalju u glavnu, referentnu laboratoriju.
Ta laboratorija zatim, zavisno o tačnosti analize, daje certifikat laboratoriji koja je sprovela analizu.
Taj test se sprovodi kako bi se dokazala tačnost i sledivost rezultata laboratorije i kako bi svaki DNA profil izrađen u laboratoriji sa ISAG certifikatom bio iste vrednosti i tačnosti i uporediv sa DNA profilima izrađenim u nekim drugim laboratorijama s ISAG certifikatom.